肿瘤微生物：瘤内微生物是如何促进胰腺癌发生？| 微生物专题

被称为“癌症之王”的胰腺癌，是一种恶性程度极高，诊断和治疗非常困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。胰腺的导管腺癌癌组织中，除了导管上皮细胞成分之外，还有大量的纤维组织。这种纤维组织的存在，造成了胰腺癌血供比较差，化疗药物的进入比较困难，5年生存率<1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。

想知道胰腺组织中有微生物存在吗？胰腺组织中的微生物的来源是什么？这些微生物对胰腺癌有影响吗？又是如何影响？

敲黑板，划重点，直接上结论

在小鼠和人类的研究中发现，癌变的胰腺与正常胰腺相比具有明显更丰富的微生物群，而与肠道相比，癌变的胰腺中的选择性细菌也有所增加。微生物消融可以防止侵袭前和侵袭性胰腺导管腺癌(PDA)，而从携带PDA的宿主转移细菌则可以逆转肿瘤保护作用。细菌消融与PDA肿瘤微环境的免疫原性重编程相关，包括骨髓源性抑制细胞减少，M1巨噬细胞分化增加，促进CD4+T细胞TH1分化和CD8+T细胞激活。细菌消融也通过上调PD-1的表达使检查点靶向免疫治疗有效。PDA微生物组通过不同地激活单核细胞中选择的toll样受体产生耐受性免疫程序。这些数据表明，内源性微生物群促进了PDA的免疫抑制特性，清除微生物组可以防止肿瘤发生，逆转肿瘤内免疫耐受，并使检查点免疫治疗的有效性得以提高。这些数据对理解胰腺癌的免疫抑制及其在临床中的逆转有意义微生物群有潜力作为调节疾病进展的治疗靶点。

文章内容：胰腺癌微生物组通过诱导先天和适应性免疫抑制，促进肿瘤发生

发表杂志：Cancer Discov

杂志分区：医学一区肿瘤学

影响因子：29.497

发表时间：2018.04

主要技术手段：免疫组化，qPCR，FISH， 16S rRNA基因测序

为了回答上述问题，作者做了六步走：

01如何确定肠内细菌是否进入胰腺？

通过口服给药给野生型(WT)小鼠荧光标记的粪肠球菌发现，细菌迁移到胰腺，表明肠道细菌可以直接影响胰腺微环境(图1A)^*1，GFP标记的大肠杆菌观察到类似的结果(图B)。FISH表示无论是在老鼠还是人类中，PDA样本中细菌含量明显远大于正常胰腺组织(图C和D)，qPCR分析也证实了相同结论(图E和F)。用抗生素处理过的野生型小鼠实验表明，Pdx1^Cre、LSL-Kras^G12D、Trp53^R172H (KPC)^*2小鼠的肠道微生物组与野生型小鼠相比，具有更高的向胰腺转移的能力(图G)。

*1：图1A除了指示肠道细菌可以迁移到胰腺，还提示了各位研究者，口服菌0.5h左右就能到达组织，6h后基本就所剩无几。如果后期研究者们要做灌胃实验，要把握好取样时间哦。

*2：KPC（LSL-Kras^G12D/+;LSL-Trp53^R172H/+; Pdx-1-Cre）Kras^G12D 是人类肿瘤中常见的 Kras 基因的活化突变体，Trp53^R172H则是 P53 基因的突变体。KPC小鼠是胰腺癌这一癌症之王的研究提供了绝好的研究工具。

02细菌是否促进胰腺异常增生的进展？

无菌KC小鼠对疾病进展和基质扩张有保护作用。与年龄相仿的对比组KC老鼠相比,无菌组显示腺泡消退延迟，胰腺异常增生减少，瘤内纤维化减少，胰腺重量降低(图H-J)。同样,在入侵原位PDA模型使用KPC驱动的肿瘤细胞,经口服消蚀抗生素治疗的WT小鼠的肿瘤负荷减少了50%(图K)。

03有哪些与胰腺发育进展相关的微生物？

在小鼠生命早期，KC组和WT组的肠道细菌群落结构相似。

拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)是优势门，但在队列间未观察到显著差异。然而，尽管放线菌在年轻的WT和KC小鼠中含量较低，但在第20周KC组中含量增加到60%。相反，放线菌在WT组中没有扩张。除铁菌在KC小鼠中也在28至36周突然增加(S2A)。在属水平上，第13周后KC的肠道微生物组与WT单独成簇(S2B)。对KC小鼠肠道微生物群落的纵向比较表明，在随后的时间点双歧杆菌富集(S2C)。线性判别分析(LDA)同样显示，与WT相比，在第13至36周，双歧杆菌在KC队列中逐渐富集(S2D)。我们发现在KC小鼠中，pseudolongum双歧杆菌是数量最多的双歧杆菌(S2E)。使用加权UniFrac距离度量计算的主坐标分析(PCoA)证实了WT和KC队列在选定时间点的肠道微生物群落存在显著差异(S2F和S2G)。Alpha多样性分析进一步表明，进展性肿瘤发生的KC队列在基于分类的丰富度(Chao1)、可观察分类单元(OTU)、Shannon多样性指数和基于系统发育的多样性(PD)方面存在显著差异(S3A,S3D)。肠道微生物群落的Alpha多样性在WT和KC队列中也不同(S3E,S3H)。

04致病菌是否会促进遗传易感宿主的胰腺癌发生？

用口服抗生素对KC小鼠的肠道细菌进行了消除，然后在22周死亡前使用WT小鼠或KPC小鼠的粪便选择性地重新填充队列。

与之前的结果一致，细菌消融对疾病进展有保护作用。此外，使用KPC来源的粪便再种群加速肿瘤生长至基线水平，而使用年龄匹配的WT小鼠粪便再种群未能显著加速肿瘤发生(图2A)。同样，在无菌KC模型中，使用携带PDA的KPC小鼠(而不是野生型小鼠)粪便的再种群，加速了疾病进展，并减轻了无菌条件下T细胞浸润(S6B;图2B-D),使用B.pseudolongum同样加速了肿瘤的发生。FISH证实了使用B.pseudolongum肠道细菌向胰腺移位(图2E)。

05微生物携带的巨噬细胞是否介导了PDA中的T细胞抑制？

我们使用CD3/CD28或来自WT小鼠或KC小鼠肠道细菌的无细胞提取物处理的脾巨噬细胞来刺激CD4+和CD8+T细胞。携带PDA宿主的肠道细菌提取物携带的巨噬细胞抑制了CD4+和CD8+T细胞的激活，通过降低CD44和PD-1的表达，并通过T-bet的表达来阻止CD4+T细胞的TH1分化(图3A,E)。

06有哪些与微生物消融相关的肿瘤保护增强适应性免疫？

我们从对照或抗生素治疗的小鼠原位KPC肿瘤中获取T细胞，并将T细胞过从皮下KPC肿瘤小鼠群中转移。对照组小鼠转移PDA浸润T细胞未能起到保护作用;然而，来自抗生素治疗小鼠的肿瘤浸润T细胞可将肿瘤负荷降低50%。

我们之前曾报道过多种PRRs，包括TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、NLRP3、Dectin-1和Mincle，在PDA中上调，它们的激活通过诱导先天和适应性免疫抑制加速肿瘤发生。我们推测，PDA微生物促进的免疫耐受是肿瘤微环境中更高的PRR激活的结果。与假设一致，我们发现来自KC小鼠肠道细菌的无细胞提取液比来自WT小鼠的肠道细菌提取液更能诱导多种PRR报告细胞系的激活，最显著的是TLR2、TLR4和TLR5(图4A)。

与对照小鼠的PDA肿瘤相比，经抗生素切除宿主的PDA肿瘤中PRRs及其相关信号分子的表达显著降低(图4B)。我们确认,类似于我们以前研究的PRRs,表达TLR2和TLR5调节巨噬细胞在PDA通过流式细胞术(图4C和D),和他们的结扎加速肿瘤的生长(图4E号通路，可以消除KPC粪便或KPC粪便重建抗生素消融小鼠的PDA促进作用(图4N)。在TLR信号被抑制的情况下，PDA微生物组携带的巨噬细胞未能抑制T细胞免疫原性，这表明PDA微生物组通过TLR信号引导TAMs诱导免疫耐受(图4O,R)。

结论

我们的研究阐明了一种与小鼠进行性胰腺肿瘤发生相关的独特肠道微生物组的存在。我们发现，胰腺拥有自己的微生物群，这与老鼠和人类的疾病阶段有关。我们还详细介绍了由微生物组诱导的胰腺内免疫编程。调节PDA微生物群以增强免疫治疗是实验性治疗的一个有吸引力的途径。此外，有必要进行前瞻性研究来鉴别具有肿瘤特异性的微生物特征，这可能具有早期诊断和风险分层的潜力。

编者说

众所周知，原核生物研究进展相比真核生物还是有相当一段差距，要想缩小这个差距，大量的测序来充实数据库是第一步，没有足够的数据支撑，前期得到的微生物类型的种类都不完善，何谈后期的精准的湿实验？按照目前形势来看，如果说肠道微生物的研究是一片待开采的金矿，组织微环境就更可谓是一片钻石矿，目前借助二代测序，研究门槛大大降低，加上常规的免疫组化，粪菌移植等实验，还怕没有大的发现？

对“肿瘤组织微生物组”研究感兴趣的老师们，欢迎咨询与讨论。

参考文献

Pushalkar Smruti,Hundeyin Mautin,Daley Donnele et al. The Pancreatic Cancer Microbiome Promotes Oncogenesis by Induction of Innate and Adaptive Immune Suppression.[J] .Cancer Discov, 2018, 8: 403-416

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